初论免疫组织化学标准化
初论免疫组织化学标准化
迈新实验室 王丽 张秋金 林齐心 王小亚 福州 350002
单克隆抗体的问世与免疫组织化学检测系统持续快速的发展，使免疫组织化学技术在现代病理诊断中的应用日益广泛，且倍受病理界的关注与青睐。最初由70年代初期仅在实验室中科研的尝试，其间历经二三十年时间，该项技术今日已发展到成为常规病理诊断中必不可少的可靠的辅助诊断手段。由于随着免疫组织化学试剂的大量涌现，1998年美国FDA颁发了《免疫组化试剂重新分类标准》，将其免疫组化试剂抗体统分为三大类，Ⅰ类抗体，在病理鉴别诊断中用于判定组织起源指标；Ⅱ类抗体，为雌、孕激素受体，用于乳腺癌患者中雌、孕激素受体的检测，雌、孕激素受体激素水平的测定以指导患者的内分泌治疗；Ⅲ类抗体，为现今仍处于科研文献论证阶段的新试剂[1]。试剂的规范化要求越来越受到重视。
分子医学的发展，治疗性的人源性单克隆抗体引入了临床，免疫组织化学技术已经作为独立的一项检测指标用于指导临床个性化治疗[2]。目前已有十几种人源性单克隆抗体，通过了临床期实验。代表性的C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达，该项免疫组织化学检测方法已经通过美国FDA认证，免疫组织化学检测结果直接指导临床治疗。ER/PR检测是目前病理科常规开展的免疫组化检查项目，每个实验室都日常进行ER/PR检测，但值得注意的是每个实验室间得出的实验结果往往大相径庭[3,4,5]，ER/PR检测的实验结果直接指导乳腺癌患者的预后与治疗，随着检测方法直接渗透到病人预后与治疗方案中，所以方法学标准化重要性的问题日趋突出与严峻。就免疫组织化学标准化的概念新近由美国国家临床实验标准化委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS）于1999年正式出台了纲要性文件[6,7,8]。随着国内免疫组织化学技术应用日益广泛，免疫组化实验结果的可靠性、可重现性以及实验室之间的学术交流也愈来愈受到高度重视。实验室间的交流需要采用通用的术语和实验规则，实验室的仪器设备、技术操作规范、实验技术人员的资格等外部环境条件都有必要得到重视[9]，这些影响因素也常常是令实验室感到棘手的问题，同时免疫组织化学实验技术在实际操作中还仍然存在着许多有待商榷的问题[2]。尽管在免疫组织化学理论上十分的简单，但日前让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果还仍然是颇为困难的事情，因为诸多的因素最终可以影响免疫组化的结果，若想得到最佳可靠的实验结果，当务之急是将免疫组织化学技术中的全部实验程序变得易于操作与掌握，达成概念上的标准化。
一、免疫组化诊断成功的关键要素
1．病理科主任
要确保实验室中免疫组化诊断成功的完成，首要关键因素是病理科主任必须具有相当过硬的免疫组化诊断知识与丰富的免疫组化技术经验，尤其在免疫组化结果与常规诊断出现矛盾时更显突出[3]。病理科主任应十分清楚免疫组织化学技术是一项实验性很强的技术，是一门需要进行继续再教育的课程，并有责任对病理医生进行不断地培训，提高他们的免疫组化诊断水平，特别是在技术人员将一张染色比较差的切片呈现在面前，以及听到病理医生抱怨病理技术人员总是做不好免疫组化染色时，更应客观地对待。病理医生往往是静止地看待免疫组化染色结果，往往这种认识是不妥当的。在实际工作中，病理科主任还需要不断地学习有关免疫组化的文献资料，加深了解多种抗体在组织中预期表达情况，避免错误的判断与解释。
2．病理技术工作者
病理技术工作者也是免疫组织化学中成功的关键因素，病理技术人员应该在制备超薄组织切片和免疫组化实验操作技术训练中过关，得到认可，要十分清楚地懂得免疫组织化学中的实验原理，并且在日常实际工作中需要及时地与病理主任进行信息交流。
3．可靠的试剂与实验方法
免疫组化实验检测方法多种多样，抗体的种类繁多，商品化的试剂也越来越简便、高效与便捷。目前绝大多数实验室使用的检测系统均为辣根过氧化物酶（HRP）为基础的检测系统，DAB显色。每个实验室必须确保购买有产品质量保证的著名厂商的试剂，值得注意的是还必须在本实验室内进行最佳实验条件的摸索工作。
4．实验质控对照的设立
免疫组织化学实验中实验对照的概念在许多实验室内都是极其容易被忽视的问题，但实验对照绝不是一个虚设的多余的程序，在每次的实验中它作为敏感性与特异性的对照作用相当的重要，且多组织芯片在对照实验中将发挥越来越大的作用。
二、免疫组化染色技术
在免疫组织化学实验中，每个实验室常选择不同的检测系统，实验技术操作方法亦不尽相同，所以做好一张满意的免疫组化切片也并非轻而易举，突出的问题是每次实验结果的稳定性与重现性较差，原因在于免疫组织化学是一项技术性很强的实验方法，它不可能有适合于所有实验室和所有抗体的唯一实验方法。但随着免疫组化的广泛应用与实验室间日益密切的信息与技术的交流，免疫组化技术的焦点已经集中在了对其标准化实质性问题的探讨上。90年代Biotin-Streptavidin-HRP方法的出现，其方法灵敏度高，操作简便，很快被各实验室广泛接受与使用。所以免疫组化标准化的讨论目前是建立在辣根过氧化物酶（HRP）检测方法基础上而进行展开的[3]。
免疫组化标准化的染色方法
1. 将石蜡组织切片粘贴在防脱玻片上；
2. 切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水至水化；
3. 灭活内源性过氧化物酶的活性，缓冲液冲洗；
4. 血清封闭孵育，缓冲液冲洗；
5. 如果需要，缓冲液冲洗，抗原修复处理（热抗原修复或酶消化）；
6. 加载相应的一抗，孵育，缓冲液冲洗；
7. 加载对应的二抗，孵育，缓冲液冲洗；
8. 加载相应的酶结合物孵育，缓冲液冲洗；
9. 加载对应的酶底物，显色，复染，脱水，封片，观察。
（一）染色前（Preanalytic or Pre-Stain）处理因素
1．取材、脱水、浸蜡
免疫组化要求组织离体后应立即固定，理想的取材厚度是2mm，组织在脱水机中的处理条件应十分妥当，大量的实验室经验公认在加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。如果H&E切片尚做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起，根本无法保证染色质量。
2．福尔马林固定
在众多的组织固定液中，如甲醛、乙醇、戊二醛、B5 、脱钙液等等不同种类的固定液，各种固定液在不同实验方法（如PCR、电镜、免疫组化、分子杂交等）的使用中各有千秋[10,11]。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林都是首选。在免疫组化中首选的固定液是10%中性缓冲福尔马林液（市售甲醛1：9稀释），福尔马林固定引起的组织抗原决定簇的封闭与交联可以通过抗原修复方法来修正[12]，为确保离体组织的抗原性，值得高度重视的是离体组织须马上固定[13,14]，病理医生有责任与手术送检科室进行配合，避免手术后的离体组织随意处置，组织离体后固定一般不要超过15分中，固定在常温条件下时间为8-24小时，同时还要注意的重要一点是要避免福尔马林过度固定造成的组织抗原损失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检出 [15]。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中。脱钙液对抗原破坏较为严重，所以脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度[16]。
3．防脱片的制备
防脱玻片的处理各个实验室间一般多采用不同的粘附剂，目前通用的是Sigma多聚左旋赖氨酸（Poly-L-lysine）或硅化片，不论是免疫组化还是原位杂交该粘附剂都具有极好的防脱片效果[17]。
4．包埋与切片
固定后的组织，过热或高温的石蜡包埋容易导致抗原的破坏，因为石蜡熔液是非缓冲体系，尤其对固定条件不佳的组织影响更大，需选用低熔点的石蜡。推荐广东茂名石蜡厂的低熔点石蜡。切片的厚度在4-5μm，过厚的切片，不仅容易脱片，还影响免疫反应及镜下观察。
5．烤片
切片在56-60℃恒温箱里烤片至少1小时才不至于脱片，迈新实验室推荐58-60℃恒温箱里烤片2小时。也有的实验室在58-60℃恒温箱里过夜烤片。但高温烤片对抗原有破坏，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。
6．切片保存
许多大的实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。在实验中迈新实验室发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况。故进行了新、旧切片的保存时间对照实验，选择11种不同组织蜡块每例连续切片10片，共110片，常温空气中放置一个月、三个月、半年、一年与新切片进行成对对照实验。实验结果表明：组织蜡块切片后在室温下保存三个月，抗原对多数抗体的敏感性约下降一半，部分切片丢失更多。切片保存半年多数的抗体不能出现阳性标记结果，保存一年以上仅有个别的切片能够有微弱的阳性表达，尤其核表达的抗原丢失更为突出。国外也有类似的资料报道。究其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，值得科研单位在连续性课题实验中注意切片的保存。
7．脱蜡
免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水至水化。
（二）免疫组化实验中的抗原修复
1. 抗原修复方法
目前在免疫组化实验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素，抗原修复方法有多种，但经过多年实验室的实验验证大多数实验室采用的是酶消化法与加热抗原修复两种方法。
（1） 酶消化法
酶消化法是最早的抗原修复方法[18,19,20,21]，消化酶的作用在于能够暴露因组织固定而导致的抗原决定簇的封闭，以增强染色效果。消化酶有多种，如胰酶、DNase 、蛋白酶K、胃酶等等，现仅有极少数的抗体可以选择酶消化的方法。由于热抗原修复方法的广泛使用，酶消化方法在免疫组织化学方法中的应用已越来越少。
（2） 加热抗原修复（Heat Induced Epitope Retrieval HIER）
加热抗原修复最初1991年由Shi等报导[22,23,24]，已经经过了10多年大量实验室的实验验证，加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。某些研究表明组织中钙结合（或其他二价阳离子）也可能是重要的影响因素。
加热抗原修复方法基本包括这几种：高压法
微波法
水煮法
有报道，英联邦8个国家免疫组织化学外部实验质量评估方案(United Kingdom National External Quality Assessment Scheme for Immunohistochemistry)由105家实验室共同参与，历时两年时间（1996.8-1998.8），对ER、 PR进行8次循环反馈实验，针对不同实验室间不同实验方法进行比较实验论证，最终实验室间得出一致性公认的实验结论：ER 、PR染色偏弱的原因，是由于微波加热时间不足与实验中操作控制不当所致，故强力推荐使用高压抗原修复方法[25]。
迈新实验室与福建省三家省级医院曾于1996年联合进行抗原修复不同方法对照实验，选择44种常用抗体，进行不同加热抗原修复方法对照实验，有高压法、微波法、水煮法三种方法，染色强度的实验对照结果是：高压法>水煮法>微波法。同时对9例ER、PR进行微波和高压抗原修复实验方法对照实验，结果显示：高压法的实验重现性与染色强度均优于微波法，见下表。
三个实验室微波和高压加热ER、PR免疫组化结果比较
实验室1 实验室2 实验室3
微波 高压 微波 高压 微波 高压
ER(9张乳腺癌切片) 5+,4- 5+,4- 3+,6- 5+,4- 5+,4- 5+,4-
PR(9张乳腺癌切片) 4+,5- 5+,4- 5+,4- 5+,4- 5+,4- 5+,4-
合计 9+,9- 10+,8- 8+,10- 10+,8- 10+,8- 10+,8-
2. 抗原修复液的选择
加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体[26]，Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。值得注意的是没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和Tris缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择EDTA和Tris缓冲修复液。
3. 加热抗原修复对组织中内源性生物素的影响
加热抗原修复在增强抗原决定簇表达的同时，也增强了组织中内源性生物素的反应。采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）方法的检测系统，组织中内源性生物素容易出现令人棘手的人为假象[27,28,29]，原因是卵白素二抗中的丙酮羧化酶中含有四个分子的生物素极易与组织中胞浆内的线粒体结合，富含的线粒体代谢旺盛的细胞中更显著，如肝脏、肾脏组织。嗜酸性细胞瘤（含丰富的线粒体）中更加严重。在许多的肿瘤组织中如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和甲状腺癌等癌组织中内源性生物素的人为假象也相当普遍。但一般这种人为假象，在DAB显色中粒细胞胞浆中常呈“泥沙”样形式存在，这些细胞与细胞间缺少同质性，一般它优先定位在细胞的一端，且呈一定的极性分布。在与一抗加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应，在没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。在以往的免疫组化染色中内源性生物素的影响因素知之甚少所以常被忽略了,而且部分文献报道也有偏差[30,31]。在各种抗原修复缓冲液对照实验中显示，Tris 和尿素对内源性生物素的反应影响最为明显，柠檬酸最低。一般在实验中凡进行加热抗原修复处理的组织都需要进行内源性生物素封闭处理，尤其值得提醒的是在概念上一定十分要清楚，阴性对照片必须与一抗的抗原修复处理条件完全相同，才能准确发现内源性生物素出现的部位。内源性生物素封闭可以通过几种方法处理，一般在抗原修复以后，采用0.05%未结合的avidin+PBS,在常温下孵育20-30分钟即可[32]，avidin可以与组织中内源性生物素结合，以消除影响。
（三）、免疫组化染色（Staining）实验操作中应用问题
1．内源性过氧化物酶的灭活
在免疫组化染色中若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理。如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞可以干扰染色结果的判断。一般采用比较缓和的方法：0.3%H2O2进行封闭处理，对染色结果及抗原保存都没有影响。嗜酸性细胞不容易灭活，但在镜下实际观察中较容易被区分开。3%H2O2对抗原可能轻微的损害，但封闭效果比较显著。
2．血清封闭
实验室使用的封闭血清，一般用在加载一抗之前，血清种属的选择一般与二抗的种属相同，可以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清，也可以免去此步骤。
3．冲洗步骤
实验室中常用的冲洗缓冲液为PBS 和TBS，Tween20加入到冲洗缓冲液中可以增强冲洗效果。在实际操作中应严格遵守实验冲洗步骤，防止因冲洗不充分引起的背景着色。
4．一抗孵育
即用型抗体（Predilute ready-to-use）厂家已进行过多种实验条件的实验检测，可按照厂家提供的实验操条件进行实验。
迈新实验室针对即用型抗体稳定性与长期保存有效性的问题做了一项实验研究，进行了长达一年时间对照追踪实验观察，随机选择5种常用即用型抗体，p53、ER、CK(AE1/AE3)、EMA和CD45RO进行效期实验，将5种即用型抗体放在37℃恒温箱内，按时间进展进行效期实验，每次5种抗体分别在相同时间里进行相同条件的免疫组化染色实验并观察其实验结果，360天的实验结果见右图，可以看出，即用型抗体在37℃条件下稳定性可以保持180天之久，4℃冷藏条件下存放24个月是稳定可靠的，所以合格的即用型抗体是经得起时间考验的，可以作为病理科常规免疫组化首选试剂，使用简单方便，易于标准化操作。同时实验也证明抗体在冷藏运输途中，一般不会引起抗体效价的降低情况。引起抗体效价降低的主要原因是反复的冻融与反复从冰箱中取出，容易导致抗体活性的损失。
浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行成倍数稀释预实验。举例，如果某一抗体厂商建议稀释度为1:50，实验要进行1:25，1:50，1:100, 1:200, 1:400梯度滴度实验。选定最佳的稀释滴度后再进行批量实验。关键注意点是要保证在已知阳性的切片中抗体滴定到完全没有阳性反应为止。一般染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或4℃冰箱过夜。
5．检测系统
通用的检测系统为生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法有SP、LSAB、ABC等，都是目前实验研究与临床实验室广泛采用的检测方法，其方法简便易行，试剂稳定。SP三步法敏感度大于EnVision,、EliVision，大约1-2倍。SP三步法高效、经济，为国内免疫组化首选的检测系统。
6．显色系统
通常采用的是辣根过氧化物酶系统，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）酶底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT（蓝紫色）,常规免疫组化显色首选的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。
7．复染
尽管衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色最终结果的质量影响很大。苏木素有不同类型，首选的是Harris苏木素衬染，Harris苏木素在水中应彻底洗涤，才可以得到亮丽的兰色衬染效果，且与DAB染色对照效果最好，在绝大多数实验室中使用简单方便。
（四）、免疫组化对照实验的设立
1．Vimentin阳性对照
Vimentin在免疫组化中作为阳性对照是由Battifora[33]提出，他提出在每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其优选于活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是过度固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。迈新实验室随机选择福建省四家省级医院病理科的81个各种组织蜡块，进行Vimentin标记批量实验，结果观察显示Vimentin 在组织中的表达率为96.7%(85/88 )。
2．实验阳性对照设立
阳性对照如何设立才是最佳？病理技术人员可能在日常一次又一次的免疫组化实验中，总在疑问选择何种对照才是合理的标准化实验对照，而且这一点也是目前一般实验室中最容易忽视的问题。如果一个相同的组织蜡块同时要做多种指标染色如CK、EMA、LCA、S-100和HMB-45时，仅需做一张阴性对照即可，无需同时做五张切片作对照[34]。但要保证阴性对照的实验处理条件要与一抗处理条件相同，一般常规免疫组化阳性对照的设立见附表。
目前国外一些实验室已采用多肿瘤组织芯片来测定抗体的特异性[35]，组织芯片中包含有15-80种不同类型肿瘤组织（包括各种癌、神经内分泌肿瘤，肉瘤，黑色素瘤，淋巴瘤等等。）目的是观察抗体在各种肿瘤或组织中是否有交叉反应，已取得满意的效果，国内北京友谊医院病理可采用多组织芯片对照技术，48种不同正常或肿瘤组织对照，取得极好的效果，有条件的实验室也应尽快采用。
对照设立
对照设立
靶组织 实验反应 实验试剂
Vimentin对照
Vimentin在间质组织中表达 反应组织固定情况 福尔马林过度固定将导致Vimentin免疫活性丢失
阳性组织对照
组织中含待测抗原 一抗与靶抗原特异性的结合的有效性 测试一抗的免疫活性
阴性组织对照
组织中不含待测抗原 检测与一抗有无交叉反应 一抗
非特异性试剂对照
（除一抗外）
与一抗待测组织相同 综合分析病人标本中观察有无非特异性反应， 了解待测组织中非特异性试剂的反应
自身组织对照
相同组织蜡块连续切片 固定、处理程序不同于对照片 一抗
（五）真阳性与假阳性的判定
实验染色结果的观察判断中，真阳性与假阳性的判定需要丰富的经验，真阳性染色结果应表达在预期对应的组织结构的抗原中，定位清晰准确，假阳性一般出现在非预期对应的组织抗原中。采用过氧化物酶检测系统，DAB显色所得出的“棕色”染色结果并非都是真阳性，假阳性一般较容易判定，因为假阳性在组织细胞结构中缺少细胞与细胞间的同质性，散在性分布。个别抗体偶尔出现定位异常，如CD20 (L26) 偶见核表达[36]。而且强调指出，阴性对照切片的实验抗原修复条件必须与一抗切片的实验条件完全一致，避免内源性生物素造成的人为假阳性以干扰染色结果的判断。
（六）免疫组化染色后(Post-Staining)的分析注意要点
免疫组化染色后染色结果的分析与解释，依靠的是医生大脑的分析，再好的技术目前还不足以能够替代人脑的综合分析。病理专家和病理技术人员能够很好地识别真假阳性是很重要的，若要发挥免疫组化染色在病理诊断中的最大优势，病理医生必须对该使用的标记物的免疫反应类型与染色结果的判断与解释应十分的熟悉，仅仅知道抗体的名字是远远不够的，否则很容易将抗体的解释误入歧途。比如部分淋巴瘤中可以出现上皮膜抗原（EMA）的表达,这并不罕见。再者NSE也不是神经内分泌细胞特异性的标记物，如果在免疫组化诊断中把NSE看作是神经内分泌细胞的特异性标记物，那将是盲目有害的。
免疫组化在鉴别诊断中的原则强调的是联合应用，组合配套（Panel）表达是至关重要的。当一例病例需要进行鉴别诊断时，病理医生首先要清楚地把可能性的诊断一一列出来，这是非常重要的，只有在认真观察研究了H&E切片及与临床病史资料以后，再选择适当的抗体进行免疫组化染色，才能确保鉴别诊断的范围缩小到最小。所以在临床病理实际工作中只有首先成为了一个好的形态学家才可能成为一个好的免疫组化专家。如果在鉴别诊断的各种可能性诊断中，没有涵盖正确的诊断，那么不管你进行了多少次免疫组化染色，都不可能递交出一份正确的鉴别诊断报告，这一点尤其要引起病理医生的高度重视。
免疫组化的负疚感，每次病理医生在选择鉴别诊断试剂时都会出现这样的困惑，比如一例淋巴瘤疑难片，是需要用二种还是三种，甚至是十种免疫组化试剂来进行鉴别？或更多种选择，惟恐增加病人不必要的经济负担，这种负疚感很普遍。但我们往往事后看到的是部分病理误诊病例的背后，常常是缺乏全面准确的免疫组化标记资料，在病理临床工作中病理医生往往忙于应付申请单，病例资料分析不完全或不充分，容易导致诊断的偏差与错误，这种诊断错误的代价往往要远远地高于免疫组化的代价。
（七）免疫组织化学的自动化
自动染色仪的不断发展也为免疫组化标准化提供了一个简便而又可靠的保证。现在最为流行的免疫组化自动染色仪是开放式自动染色仪，它是一种各种试剂高度通用的仪器，可使用绝大多数免疫组化染色的抗体、检测系统和其他试剂。另外更主要的是它还具有以下主要优点：首先，它使用电脑自动化控制代替实验室技术人员手工操作，大大地减少了由于人工操作中出现误差的机会。而且，自动染色仪能精确定量泵出严格地按控制每次滴加试剂的量，空气压缩机能均匀地吹去切片上多余的液体，电子计时器将染色时间精确到秒，这一切避免了免疫组化染色过程中手工操作的偶然误差。同时，自动染色仪还可以提供所有染色步骤的详细细节。这些的特点都确保了染色结果的一致性与重现性。不同实验室间通过选择相同的染色过程及试剂，就可以达到相同的染色结果。现在，几千台免疫组化自动染色仪在世界各地的实验室里扮演着十分重要的角色，已成为了免疫组化标准化中必不可少的工具。在国内，免疫组化已经经历了十几年的手工操作阶段，手工操作技术也已经非常成熟，但随着国际免疫组化标准化的要求，免疫组化自动染色仪也逐步进入我们的病理科。就国内医院使用免疫组化自动染色仪的反馈来看，免疫组化自动染色仪使实验室技术人员从繁琐的手工操作中解放出来，大大提高免疫组化工作的效率，同时也推动免疫组化标准化又上了一个新的台阶。
（八）免疫组织化学实验报告
免疫组化实验报告已经融合在病理常规报告中，报告除了供本医院病理科与手术送检科室间进行程序化的规范使用外，对院外病理科实验室间的交流也日益广泛，故通用的标准化免疫组化报告是必不可少的，可参见《诊断免疫组织化学》一书中的格式[37]。国外实验室的免疫组化实验报告还包括如下内容，一是病人的一般资料介绍；二是强调要注明标本固定液的类型是否是由中性缓冲福尔马林固定；三是详细的实验操作方法与程序；四是注名选择一抗的品名、克隆号、细胞定位及表达意义（如广谱角蛋白Cytokeratin-Pan， 克隆号AE1/AE3，胞浆阳性，标记上皮组织）；五是实验对照设立（外部阳性对照、阴性对照、自身组织对照、Vimentin指导对照）[38,39,40]。
三、免疫组织化学技术的不断完善
免疫组织化学技术经过了二三十年的科研与临床的应用，已被全球广泛认可。该项技术仍然是一项十分复杂的实验技术方法，随着临床实际应用的意义越来越重大，作为一项十分精确可靠的、重现性强的体外诊断技术方法，还需要继续三方面的工作要做。
1． 继续医学再教育
2． 技术的日益完善与必要的实验室间的交流和信息的共享
3． 实验室资格认证
所有实验室应继续加强对免疫组化理论课程与文献资料的学习，同时要在工作实践中不断总结实验经验，完善免疫组化染色技术，让它发展成为一种精确可靠的实验方法[6,9,41]。同时规范免疫组织化学试剂厂商的产品质量认证。医学会对各个实验室间的实验条件与从业人员进行标准化监控认证，以保证实验技术的可行性与可靠性。
目前，经过权威资料认证的免疫组化实验方法已最大范围解答了免疫组化最基本的问题，尽管在你的实验室也可能认为不是都完全适用。但它仍然可以作为目前免疫组化技术中一种相对的“金标准”，通过它可以对各种实验室的实验方法进行比较衡量是有实际意义的，而且免疫组织化学标准化概念的推广也已经是事在必行，得到病理业界的公认。综上所述简言之，免疫组织化学标准化概念的主题思想简要如下：
1． 有丰富经验的病理科主任
2． 经资格认证的技术人员
3． 合格的即用型免疫组化试剂
4． 可靠稳定的标准化实验操作方法
5． 采用中性缓冲福尔马林固定液组织固定
6． 高压加热抗原修复方法
7． pH6.0柠檬酸抗原修复液
8． 实验对照的正确设立
9． 真、假阳性的正确判断
10． 免疫组化染色自动化
11． 鉴别诊断中抗体的联合应用
12． 染色结果镜下合理的判断与解释
13． 标准化的免疫组化实验报告
参考文献
1. Robinowitz,M. Revised comments on the final ruling for IHCS[editorial], Appl immunohistochem. 1998; 6:116-117
2. Taylor CR. The total test approach to standardization of immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med. 2000;124:945-51.
3. Barnes DM, Millis RR, Beex LV, et al. Increased use of immunohistochemistry for oestrogen receptor measurement in mammary carcinoma: the need for quality assurance. Eur J Cancer 1998; 34:1677-82.
4. Anstey AV, Ryan A, Rhodes LE, et al. Characterization of photosensitivity in the Smith-Lemli-Opitz sy- ndrome: a new confenital photosensitivity syndrome. Br J Dermatol 1999; 14134
5. Rhodes A, Jasani B, Barnes DM, et al. Reliability of immunohistochemical demonstration of oestrogen receptors in routine prac-tice: interlaboratory variance in the sensi- tivity of detection and evaluation of scoring systems. J Clin Pathol 2000;53:125-30.
6. O’Leary TJ, Edmonds P, Floyd AD, et al. Quality assurance for immunocytochemistry Approved gui- deline. Wayne, PA: NCCLS,1999.
7. Jasani B, Schmid KW. Staff requirements, quality assurance, and research and development. In: Im- munocytochemistry in diagnostic histopathology. Edinburgh, Scotland: Churchill Livingstone, 1993: 175–7.
8. Taylor CR, Cote RJ. Standardization and quality control in immunohistochemistry.In: Taylor CR, Cote RJ, eds. Immunomicros-copy:a diagnostic tool for the surgical pathologist, 2 nd ed. Phila-delphia: WB Saunders, 1994:425–6.
9. Fetsch PA, Abati A. Overview of the clinical immunohistochemistry laboratory: regul- ations and trou- bleshooting guidelines. Methods Mol Biol 1999;115:405–14.
10. Athanasou NA, Quinn J, Heryet A et al. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cell- ular antigens. J Clin Pathol 1987;40:874-878.
11. Arber JM, Arber DA, Jenkins KA et al. Effect of decalcification and fixation in paraffin-section imm- unohistochemsitry. Appl Immunohistochem 1996;4(4):241-248.
12. Battifora H, Kopinski M: The influence of protease digestion and duration of fixation on the immuno- staining of keratins: A comparison of formalin and ethanol fixation. The Jou-rnal of Histochemistry and Cytochemistry 34:1095-1100, 1986.
13. Taylor CR. The total test approach to standardization of immunohistochemistry.Arch Pathol Lab Med 2000;124:945–51.
14. Wick MR. Quality assurance in diagnostic immunohistochemistry. A discipline coming of age. Am J Clin Pathol 1989;92:844.327–43.
15. 郑杰，第23届名古屋国际病理学术会议. 中华病理学杂志，2001,30
16. Mukai K, Yoshimura S, Anzai M: Effects of decalcification on immunoperoxidase staining. Am J Surg Pathol 1986;10:413-419.
17. Henderson C: Aminoalkylsilane: An inexpensive, simple preparation for slide adhesion. J Histochem Cytochem 12(2):123-124, 1989.
18. Battifora H, Kopinski M: The influence of protease digestion and duration of fixation on the immuno- staining of keratins: A comparison of formalin and ethanol fixation. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 34:1095-1100, 1986.
19. Pinkus GS, O’Connor EM, Etheridge CL et al. Optimal immunoreactivity of keratin proteins in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue requires preliminary trypsinization. An immunoperoxidase study of various tumors using polyclonal and monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem 1986;34:1095-1100.
20. Andrade RE, Hagen KA, Swanson PE, et al. The use of proteolysis with ficin, for immunostaining of paraffin sections. A study of lymphoid, mesenchymal, and epithelial determinants in human tissues. Am J Clin Pathol 1988;90(1):33-39.
21. Ordonez NG, Manning JT, Brooks TE: Effect of trypsinization on the immunostaining of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Amer J Surg Pathol 1988;12(2):121-129.
22. Shi S-R, Key ME, Kalra KL: Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhanc- ement method for immunohistochemical staining based on microwave heating of tissue sections. J Histochem Cytochem 1991:39:741-748
23. Catoretti G, Pileri S, Parravicini C et al. Antigen unmasking on formalin-fixed paraffin-embedded se- ctions. J Pathol 1993;171:83-98.
24. Taylor CR, Shi SR, Chaiwun B et al. Strategies for improving the immunohistochemical staining ofvarious intranuclear prognostic markers in formalin-paraffin sections: Androgen receptor, estrogen receptor, progesterone receptor, p53 protein, proliferating cell nuclear antigen, and Ki-67 antigen revealed by the antigen retrieval technique. Human Pathology 25:263-270, 1994.
25. Anthony Rhodes，Bharat Jasani, et al. Study of Interlaboratory Reliability and Repro- ducibility of Estrogen and Progesterone Receptor Assays in Europe .Am.J Clin Pathol 2001
26. Elias J, Margiotta M: Low temperature antigen restoration of steroid hormone receptor roteins in routine paraffin sections. J Histotechnol 1997;20(2):155-158.
27. Miller RT, Kubier P: Blocking of endogenous avidin-binding activity in immunohistochemistry: The use of egg whites. Applied Immunohistochemistry 5(1): 63-66, 1997.
28. Fan Z, Clark V, Nagle RB: An evaluation of enzymatic and heat epitope retrieval methods for the immunohistochemical staining of the intermediate filaments. Applied Immunohistochemistry 5(1): 49- 58,1997.
29. Rodriguez-Soto J, Warnke RA, Rouse RV: Endogenous avidin-binding activity in praffin-embedded tissue revealed after microwave treatment. Applied Immunohistochemistry 5(1): 59-62, 1997.
30. McCluggage WG, Maxwell P, Patterson A et al. Immunohistochemical staining of hepatocellular carcinoma with monoclonal antibody against inhibin. Histopathology 1997; 30:5168-522.
31. Wood GS, Warnke R: Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 29(10): 1196- 1204,1981.
32. Battifora H: Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology 96:669-671, 1991.
33. O’Leary TJ, Edmonds P, Floyd AD, et al. Quality assurance for immunocytochemistry. Approved guideline. Wayne, PA: NCCLS,1999.
34. Miller, RT: Multitumor "Sandwich" Blocks in Immunohistochemistry. Simplified Method of Preparation and Practical Uses. Applied Immunohistochemistry 1(2):156-159, 1993.
35. Sickel JZ, Sant'Agnese PA: Anomalous immunostaining of 'optically clear' nuclei in gestational endometrium. A potential pitfall in the diagnosis of pregnancy-related herpesvirus infection. Archives of Pathology and Laboratory Medicine 118:831-833, 1994.
36. Taylor CR. The total test approach to standardization of immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med 2000;124:945–51.327–43.
37. 纪小龙，施作霖. 诊断免疫组织化学.军事医学科学出版社，1997；26-27
38. Banks PM. Incorporation of immunostaining data in anatomic pa-thology reports. Am J Surg Pathol 1992;16:808.
39. Banks PM, Battifora H, Corson JM, et al. Incorporation of immu-nostaining data in anatomic pathol- ogy reports. Am J Clin Pathol 1993;99:7.
40. Kraemer BB. Quality assurance activities of the College of Ameri-can Pathologists. Acta Cytol 1989;33: 434–8
摘自中国病理网
