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细胞涂片染色分析

细胞涂片染色分析

[这个贴子最后由yds在 2005/06/07 08:55pm 编辑]

学习细胞学时,对常规的技术环节曾作了大致总结,请指正:
染色不良原因分析
细胞涂片常规巴氏染色步骤及原理:
具体步骤:
1、涂片投入95%酒精固定液   固定15分钟。
   目的:细胞及胞内物质形态稳定(由半液态变为半固态),易于染色。
   原因:固态比液态(流动性)更具稳定性,着色更迅速,染色效果也更稳定。
2、水洗  用浓度由高到低的 梯度酒精 入水 或直接 自来水漂洗。
   目的:脱醇—置换出细胞内酒精,以便使水溶性苏木素进入。
3、苏木(水溶液)染核  时间灵活掌握,根据镜下观察染色效果 确定。
4、水洗 洗去过多残留苏木染液,
5、碱水(饱和碳酸锂)返蓝
目的:使苏木色精进一步形成,且使胞浆偏碱性,以便更好的与酸性染料结合。
6、水洗去多余碱水。
7、脱水  用浓度由低到高的 梯度酒精 或直接由水进入95%酒精。
8、橘黄和EA(O—E染色)染胞浆
   操作:每次染后 进入 95% 酒精漂净多余染液,以保证 不影响 下一步。
9、无水酒精脱水 —— 二甲苯透明 —— 树胶封固。
可能出现误差的步骤:
1、固定时间要求是:大于15 分钟,小于48小时。
如果制完片后马上进入水洗染色,固定效果必然欠佳。
2、水洗脱醇 应保证足够的时间和换水次数,
否则脱醇不彻底,会干扰水溶性苏木素进入细胞内进行染色反应。
3、苏木素的染色效果与本身的浓度、纯度,染色反应的速度直接相关。
   此外,染色速度还受温度影响(温度越高,染色速度越快,效果越好)。
   
所以:本步骤注意事项为:
苏木素的质量——每日过滤并加新液;
天气温度(室温)的变化——调整时间,温高则时间短,温度低则时间长,皆以镜下观察的效果为准灵活掌握。
4、碱水返蓝:
   为水溶液,其浓度和纯度都会影响返蓝效果。
   如果碱水使用时间过长,未及时更换,其浓度、纯度必然下降。
   为加快速度或工作时间调整,玻片放入碱水中的时间常常偏长或偏短。
   偏短——苏木色精形成不充分;
   偏长——涂片在水溶液中浸泡过久会影响细胞固定效果,从而影响染色效果。
   以至于影响苏木素的显色效果和下一步胞浆染色效果。
5、橘黄和EA的染色效果,
由 染液质量(配方、浓度、纯度)和染色时间 决定。
   且橘黄和EA一般都使用醇溶液,所以,此前的酒精漂洗脱水步骤也很重要。
   
   此外,温度对效果的影响也和苏木素一样。
   
6、酒精的浓度、纯度受温度和使用率的影响。
   气温上升,会使酒精挥发——浓度下降,导致以下效果
   ● 固定效果不佳,影响染色。
   ● 脱水不彻底,影响胞浆染色;
   ● 脱水不彻底,影响二甲苯透明。
7、透明
   二甲苯透明不充分,镜下观察的效果就是结构模糊——不透明、不清亮的感觉。
   比喻:透明良好的效果象是泡在清水中,清澈见底;
         不透明 或透明效果不好 就象是泡在米汤或胶水中,(或是嵌在毛玻璃内),
         感觉模模糊糊,看不清结构。
此外,还可用石蜡油做透明剂。
8、有些医院的巴氏染色效果很好,几年不褪色,而效果不好的最快三五个月就开始褪色。
   我观察实验的结果是:EA染色有问题。褪色的涂片残留的颜色为红色,而且是苏木精被还原后呈现的红色,而EA中的伊红、淡绿颜色全无;所以,应该注意:
   伊红、淡绿的染色效果——包括原液的质量和配制;如酸碱度的调整;还有就是操作。
   
9、所有的染液和洗液都应定时过滤、定时更换。
其中的很多原理至今我也没弄清楚,翻了一些书也是操作过程、结论明确,但原理未分析透彻,或许是因为自己水平太浅,期待出现一本简明扼要因果清晰的书。

                                               

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细胞涂片染色分析

其实以上所有细节书中都有强调,只是具体操作者需用心而已。
如果还是做细胞涂片的话,HE染色的基本要点和EA差不多。
没什么秘诀。

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