尾状叶

各位老师，最近一段时间开始接触冰冻切片，所切的标本是四个月前在医院取的人肝癌标本，当时是取的新鲜标本，然后装入冻存管，直接丢入液氮中，几小时后转入负八十度冰箱保存。现在我取出来之后放入冰切机内，负20度，用OCT包埋，包埋好后切片，结果组织形态相当差，在看DAPI时有时甚至看不到核，只有丝状的东西。后来我考虑可能是包埋剂本身也是让组织有个冻融的过程，会造成组织缓慢复温，破坏结构。后改成包埋剂覆盖组织后马上入液氮降温，不过现在切出来的结构也不是太好，但有改观。
我对于这个结果很不满意，因为上次取标本时没有考虑到这些问题。现在请教其他人，有的也是用这种方法做的，只是说组织边缘形态差些，这也坚定了我认为是包埋剂冻融组织的缘故。我现在想再次去取标本，在这里想请教一下大家几个问题：
1、直接放液氮中冻存后冰切这个方法是否可行？如果我先用包埋剂包埋后再入液氮冷却是否可以，教科书上说要置于液氮表面，而不能一开始就浸没入液氮，这是什么道理，是不是怕组织碎掉？还有说法是在锡纸内用包埋剂包埋组织，置于盛有异WU烷的容器后再浸入液氮，具体该用什么方法更好呢？如果用最后一种方法，用来盛异WU烷的容器应该是什么材料的呢，用玻璃的可以吧？
2、蔗糖梯度脱水同速冻哪个对组织形态的保护更好？但因为梯度脱水前要用甲醛类的固定液固定，而我的抗体又不能用于做石蜡包埋标本（我觉得不能做的原因可能就是因为甲醛的缘故），所以是不是有其它的固定液可供选择？
3、切完的冰切片应该立即固定后置于负八十度保存，负二十度可以吗？还有就是保存时需要密闭吗，意思就是如果组织片表面结冰后在室温解冻会否对结构有影响？我之前放在负二十度，等拿出来后其它的片子也化了，再放入负二十度这个冷冻过程对片子会不会有影响？
谢谢！