junyi4444

我想用新鲜冰冻组织做免疫组化，方法如下：


      术中冰冻的新鲜组织，在恒温冰冻机中零下18—20度冰冻10分钟左右，切片4微米，（明胶片和普通片各捞一张），然后进入4度的丙酮固定20分钟，水洗，进蒸馏水，再进3%双氧水消除内源过氧化物酶15分钟。进PBS振洗，再用血清37度封闭10分钟。然后再加一抗，二抗等等，按常规的免疫组化来做。

  我的方法对吗？冰冻的温度.时间应该是多少呢？组织切多厚好些呢？内源过氧化物酶是不是用双氧水甲醇效果更好些呢？

   到最后总是掉片，胶片的稍微好一些。是不是因为中间用PBS振洗的次数多了呢？


这是怎么回事呢？

junyi4444

是不是冰冻组织得先在-40°——-70°中冷冻30——60分钟，再恒温切片呢？

junyi4444

网上找到一篇


实验所使用冷冻切片机型号为MLCROM HM505E,固定液的配制参照文献[1]并做适当改进:95%乙醇49.5ml与乙醚49.5ml两者混合后加入冰醋酸1ml。1.2方法①5μm厚冷冻切片裱与普通清洁的载玻片上(无需防脱片处理);②固定液中固定1min;③流水冲洗30s,蒸馏水洗30s;④内源性生物素的封闭:⑤滴加一抗37℃温箱湿盒中作用30min,PBS洗1min×3次;⑥滴加二抗37℃温箱湿盒中作用15min,PBS洗1min×3次;⑦滴加DNB显色1min,水洗30s;⑧苏木**复染15s、分化、水洗,促蓝液中10s,脱水封片

junyi4444

老师们，。教教我吧，。急呀。

网上也找不到类似的

shanghainese

Frozen Sections 冰冻切片
      Snap frozen fresh tissues in liquid nitrogen or isopentane pre-cooled in liquid nitrogen, embedded in OCT compound in cryomolds. Store frozen blocks at - 80 ºC.  新鲜组织包埋在装有OTC的冰冻包埋盒里，放入液氮或液氮预冷的异戊烷中速冻。冰冻快储存在-8 0º冻箱里。
      Cut 4-8 um thick cryostat sections and mount on superfrost plus slides or gelatin coated slides. Store slides at - 80 ºC until needed. 冰冻切片 4-8 微米，贴在superfrost plus 或涂有明胶的（防脱）载玻片上。片子储存在-8 0º冻箱里直到用时。
      Before staining, warm slides at room temperature for 30 minutes and fix in ice cold acetone for 5 minutes. Air dry for 30 minutes.  染色之前，切片在室温复温30分钟，冷丙酮固定5分钟。然后再空气干燥30分钟。
     Wash in PBS 磷酸缓冲液洗。

shanghainese

染色
进3 ~ 0.3%双氧水消除内源过氧化物酶15分钟。PBS洗，再用血清37度封闭10 ~ 30分钟 （可省）。然后再加一抗，二抗等等，按常规的免疫组化来做。

shanghainese

PBS冲洗，浸洗就可以了。

junyi4444

shanghainese老师

    我们科没有液氮和-8 0º冻箱，能做吗？只有莱卡的恒温冰冻切片机。
    我是把送来的术中冰冻组织直接取材，（不包埋，不放入液氮或液氮预冷的异戊烷中速冻）然后放在恒温冰冻切片机中，-20度冷冻，大概10分钟，硬了以后就切片5微米片子，（也不储存在-8 0º冻箱，）稍干后直接冷丙酮固定，这样可以吗？

    术中冰冻切片 4-8 微米，也就相当与HE的2-4微米吧，我切5微米是不是有点太薄了呢？

junyi4444

我科冰冻切片机

shanghainese

引用:

原帖由 junyi4444 于 2008-12-5 18:59 发表
shanghainese老师

    我们科没有液氮和-8 0º冻箱，能做吗？只有莱卡的恒温冰冻切片机。
    我是把送来的术中冰冻组织直接取材，（不包埋，不放入液氮或液氮预冷的异戊烷中速冻）然后放在恒温冰冻切片机中 ...

可以这样做，但是容易产生冰结晶。
切5微米一点不薄。