关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢
小妹做免疫组化已经有一段时间了、条件一直摸不准、现在最棘手的问题是：
1、苏木精复染后整张片子的核不是蓝色、而是发红、有人跟我讲可能是苏木精的配置问题或是苏木精过期所致、但是我师姐之前是用一样的苏木精做的免疫组化、没有问题的、核染得很得当，到我这里怎么不行了呢、还有人跟我讲是DAB显色过度导致、我不明白这是什么概念，我显色了6分钟、算是过度了吗？补充一下我用的是武汉博士德的免疫组化试剂盒。
2、再有、我做阴性对照、总是会有阳性着色的地方、是内源性酶和生物素没处理好吗？我灭活了20分钟、封闭了20分钟
3、我拜读过很多人的贴子、有的说免疫组化苏木精复染后不要分化、有的说需要分化、那到底要不要分化？我迷惑了、、、我的核本来就染不上色、分化了是不是更染不上了？
4、为了让各位高手及老师更清楚的找到我的问题出现在哪里、下面我附上我的实验步骤、请详读，谢谢：
（1）切片（切片机)、展片（40度左右）、烘片(37度24小时以上但不超过28小时）
（2）脱蜡至水（二甲苯15min、二甲苯15min、二甲苯：乙醇=1：1 5min 、100%酒精5分钟、95%酒精、90%酒精、80%、70%、60%、50%、30%酒精中各5分钟、蒸馏水中30分钟）
（3）3%H2O2灭活内源性酶20分钟、蒸馏水洗3次
（4）热抗原修复 （构橼酸缓冲液 反复两次 、后自然冷却至室温）PBS洗2min*3次
（5）滴加5%BSA封闭液 室温20分钟 倒掉其余液体 不洗
（6）添加一抗 1：100 37 度45分钟 PBS洗2min*3次 同时做对照、用PBS替代一抗
（7）滴加二抗 室温20分钟 PBS洗2min*3次
（8）滴加SABC 室温20分钟 PBS洗5min*4次
（9） DAB显色6分钟、现配现用 、蒸馏水洗
（10）苏木精复染2分钟、蒸馏水洗净、
（11）盐酸酒精分化3~5秒 自来水洗净、浸在自来水中5分钟
（12）梯度酒精（70%、80%、95%、100%）各3分钟脱水，二甲苯：酒精=1：1，纯二甲苯、纯二甲苯各15min透明，中性树胶封片、镜检
请各位高手及老师指点迷津、小妹不胜感激。
