返回首页 | 病理技术专题 | 病理资讯 | 病理图库 | 病理技术精英 | 同行交流 | 技术会诊 | 点滴经验 | 常规切片 | 特殊染色 | 分子免疫 | 细胞园地 | 电镜技术 | 收藏本站
发新话题
打印

关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢

关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢

小妹做免疫组化已经有一段时间了、条件一直摸不准、现在最棘手的问题是:
1、苏木精复染后整张片子的核不是蓝色、而是发红、有人跟我讲可能是苏木精的配置问题或是苏木精过期所致、但是我师姐之前是用一样的苏木精做的免疫组化、没有问题的、核染得很得当,到我这里怎么不行了呢、还有人跟我讲是DAB显色过度导致、我不明白这是什么概念,我显色了6分钟、算是过度了吗?补充一下我用的是武汉博士德的免疫组化试剂盒。
2、再有、我做阴性对照、总是会有阳性着色的地方、是内源性酶和生物素没处理好吗?我灭活了20分钟、封闭了20分钟
3、我拜读过很多人的贴子、有的说免疫组化苏木精复染后不要分化、有的说需要分化、那到底要不要分化?我迷惑了、、、我的核本来就染不上色、分化了是不是更染不上了?
4、为了让各位高手及老师更清楚的找到我的问题出现在哪里、下面我附上我的实验步骤、请详读,谢谢:
  (1)切片(切片机)、展片(40度左右)、烘片(37度24小时以上但不超过28小时)
  (2)脱蜡至水(二甲苯15min、二甲苯15min、二甲苯:乙醇=1:1  5min   、100%酒精5分钟、95%酒精、90%酒精、80%、70%、60%、50%、30%酒精中各5分钟、蒸馏水中30分钟)
   (3)3%H2O2灭活内源性酶20分钟、蒸馏水洗3次
   (4)热抗原修复 (构橼酸缓冲液 反复两次 、后自然冷却至室温)PBS洗2min*3次
   (5)滴加5%BSA封闭液 室温20分钟  倒掉其余液体 不洗
   (6)添加一抗 1:100     37 度45分钟   PBS洗2min*3次   同时做对照、用PBS替代一抗
   (7)滴加二抗  室温20分钟    PBS洗2min*3次
   (8)滴加SABC   室温20分钟   PBS洗5min*4次
   (9) DAB显色6分钟、现配现用 、蒸馏水洗
   (10)苏木精复染2分钟、蒸馏水洗净、
   (11)盐酸酒精分化3~5秒  自来水洗净、浸在自来水中5分钟
    (12)梯度酒精(70%、80%、95%、100%)各3分钟脱水,二甲苯:酒精=1:1,纯二甲苯、纯二甲苯各15min透明,中性树胶封片、镜检
    请各位高手及老师指点迷津、小妹不胜感激。

TOP

回复 3# 的帖子

我是用PBS替代一抗做的对照。。至于阴性上面的着色是某个地方着色、并不是全片着色、您能帮着分析下市什么原因吗?谢谢

TOP

好的、

TOP

回复 6# 的帖子

关于“PBS替代一抗做对照意义不大”您能不能讲的具体一点、、还有您说的Isotype Control 我不懂是什么东西、、我免疫组化这块还是菜鸟级别、、我是本科生做毕业论文所用,谢谢您不吝指教!

TOP

回复 8# 的帖子

原来如此、、谢谢您嘞!

TOP

回复 2# 的帖子

shanghainese老师、我想给您发张我做免疫组化的照片、让您帮忙看看我的问题出在哪里了、可是我不知道怎么发、您能否给个您的邮箱、我直接发到您邮箱去、谢谢您嘞、

TOP

发新话题